Jerome Kluza

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) constituent un ensemble d'hémopathies malignes caractérisées par l'expansion clonale dans la moelle osseuse de précurseurs de cellules sanguines bloqués à un stade précoce de leur différenciation, les blastes. Le diagnostic et le suivi de la maladie reposent sur différents examens biologiques et biochimiques des blastes du sang et de la moelle osseuse. La faible survie observée dans les LAM, 24% 5 ans après le diagnostic, s’explique entre-autre par le fait que même si deux tiers des patients répondent initialement au traitement, la majorité d’entre eux finiront par rechuter. L’orientation du choix thérapeutique repose sur l’évaluation de critères cytogénétiques et moléculaires qui conduisent à la classification en groupes pronostiques identifiés selon les recommandations de l’ELN. Cependant cette classification présente des limites. Pour améliorer sa prédictivité, de nouveaux biomarqueurs complémentaires doivent être identifiés et caractérisés. Au cours de cette thèse, nous avons dans un premier temps développé une méthodologie robuste et fiable pour mesurer la consommation d'oxygène de cellules leucémiques de patients atteints de LAM afin d'évaluer les différents états de la phosphorylation oxydative mitochondriale comme potentiel biomarqueur fonctionnel des LAM. Puis nous avons appliqué cette méthodologie pour mesurer les différents paramètres métaboliques des blastes issues du sang de 58 patients atteints de LAM isolées au moment du diagnostic.

Nous avons d'abord développé un protocole pour mesurer, à l'aide du Seahorse XFe24, les différents états de la consommation d’oxygène mitochondriale de blastes isolés de la moelle ou du sang. Nous avons montré qu’il était possible de mesurer le métabolisme énergétique de ces cellules directement après le prélèvement, après 18 heures de cultures ou après la mise en culture suite à leur cryoconservation. Ces protocoles ont été développés afin de mesurer : la consommation d'oxygène mitochondriale (couplée ou non à la synthèse d'ATP) et la capacité de réserve respiratoire (SRC) qui correspond à la capacité des cellules à accélérer la chaine respiratoire après exposition au protonophore FCCP.

A partir d'une étude de cohorte prospective (58 patients), nous avons évalué les différents états de la consommation d'oxygène mitochondriale de blastes issues de sang de patients atteints de LAM. Les analyses biostatistiques, basées sur le calcul du risque relatif instantané (hazard ratio, HR), ont déterminé que SRC était significativement corrélée à la survie des patients. Après discrétisation de la SRC, nous avons établi un seuil distinguant deux groupes de patients. Les patients présentant des blastes avec une SRC supérieure à 75 pmol d’O2.min-1présentent une survie significativement plus élevée que les patients avec des blastes dont la SRC est inférieure à ce seuil.

Nous avons caractérisé les événements biochimiques associés à l'accélération de la chaîne respiratoire à partir de différentes lignées de LAM ou de blastes issus de patients. En utilisant des inhibiteurs pharmacologiques (BPTES, UK5099 et Etomoxir), des approches d'ARN interférence (knock-down MPC2) et des analyses de métabolomiques (après incubation avec de l’[U13C]-Glucose ou de l’[U13C]-Glutamine), nous avons démontré que l'oxydation du pyruvate via la pyruvate déshydrogénase était une voie majeure activée durant l’accélération de l’activité de la chaîne respiratoire induite par le FCCP.
En conclusion, nous avons démontré qu’il existait une hétérogénéité du métabolisme oxydati
f des blastes issues du sang de patients atteints de LAM et que la SRC permettait de distinguer deux groupes de patients dont la survie est significativement différente. Ces résultats établissent une base méthodologique solide utilisable en clinique et montrent l’intérêt de la SRC en tant que potentiel biomarqueur pour compléter les biomarqueurs actuels utilisés pour établir la classification ELN.